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内切酶的特性、酶解与琼脂糖凝胶电泳

发布时间:2015-03-16

    学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法,理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。

限制性核酸内切酶:
    是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。

琼脂糖凝胶电泳:
    是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率,因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片段。
 

    EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入,在紫外光的照射下,凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光,易于检测。可以检测10ng 的DNA。

    质粒 pCMV-Myc-T10 NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder) EcoR1 和 Xho1 核酸内切酶(Takara) EcoR 1和 Xho 1酶解缓冲液(10×H buffer) 琼脂糖 TBE或TAE缓冲液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(6×):0.25% 溴酚兰,40%(W/V)蔗糖 水溶液或30%的甘油。 电泳仪,电泳槽,紫外透射仪,凝胶成像仪,一次性塑料手套等 .

1) 质粒DNA的酶解(自提质粒pCMV-Myc-T10)

 
质粒量(ng)
缓冲液(μl)*
EcoR1(μl)
Xho1(μl)
H2O (μl)
总体积(μl)
I
200
2
0
0
17-19
20
II
200
2
0.5
0
15-17
20
III
200
2
0.5
0.5
14-16
20

* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。 置于37℃水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后,分鸺尤?0?l 3倍的上样缓冲液, 然后各取15?l进行电泳分析。

2) 琼脂糖凝胶的制备:
    称取0.8g琼脂糖,置于三角瓶中,加入100ml TBE或TAE工作液,瓶口倒扣一个小烧杯等,将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。

3)胶板的制备:
    取有机玻璃内槽,洗净、晾干;取纸胶条(宽约1cm),将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上,放好梳子。 将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液,小心地倒在有机玻璃内槽上,控制灌胶速度和量,使胶液缓慢地展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右,待凝固完全后,轻轻拔出梳子,在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1×TAE(Tris-乙酸) 或TBE(Tris-硼酸)工作液的电泳槽中使用。

4)加样:
    用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品,换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部,本实验样品孔容量约15~20 ul。1 kb DNA ladder(共10条带): 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6ul 的 1 kb DNA ladder(50ng/ul )。

 

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